I microscopi a fluorescenza possono essere divisi in due tipi secondo il principio del percorso ottico:
1. Microscopio a fluorescenza di trasmissione
I microscopi di fluorescenza più vecchi usano un riflettore per eccitare la fluorescenza passando la sorgente di luce di eccitazione attraverso il materiale del campione. Il suo vantaggio è una forte fluorescenza a basso ingrandimento, ma il suo svantaggio è che la sua fluorescenza diminuisce con l'aumentare dell'ingrandimento. Quindi è adatto solo per osservare materiali per campioni più grandi.
2. Microscopio a fluorescenza in calo della luce
La luce di eccitazione cade dalla lente oggettiva sulla superficie del campione, usando lo stesso obiettivo del condensatore di illuminazione e la lente obiettiva per la raccolta di fluorescenza.
Un splitter a raggio a doppio colore (specchio dicroico) deve essere aggiunto al percorso ottico, che forma un angolo di 45 gradi con l'asse ottico. La luce di eccitazione si riflette nella lente oggettiva e si concentra sul campione. La fluorescenza generata dal campione, nonché la luce di eccitazione riflessa dalla superficie della lente oggettiva e del vetro di copertura, immettere contemporaneamente la lente obiettiva e tornare allo splitter a raggio a doppio colore per separare la luce di eccitazione e la fluorescenza. La luce di eccitazione residua viene quindi bloccata dall'assorbimento del filtro. Se vengono utilizzate diverse combinazioni di filtri di eccitazione, separatori a fascio a doppio colore e filtri bloccanti, possono soddisfare le esigenze di diversi prodotti di reazione fluorescente.
I vantaggi di questo microscopio a fluorescenza sono l'illuminazione uniforme sul campo, l'imaging chiaro e la fluorescenza più forte con ingrandimento maggiore.
3. microscopio a contrasto di fase
Il microscopio a contrasto di fase è un microscopio in grado di convertire la differenza di fase (o la differenza del percorso ottico) generato quando la luce passa attraverso un oggetto in cambiamenti di ampiezza (intensità della luce). Utilizzato principalmente per osservare cellule vive, sezioni di tessuto non macchiate o campioni colorati privi di contrasto.
L'occhio umano può solo distinguere i cambiamenti nella lunghezza d'onda (colore) e l'ampiezza della luce visibile, ma non è in grado di distinguere i cambiamenti nella fase. La maggior parte dei campioni biologici sono altamente trasparenti e l'ampiezza delle onde di luce rimane sostanzialmente invariata dopo aver attraversato, con solo cambiamenti di fase.
Il microscopio a contrasto di fase converte sostanzialmente la differenza del percorso ottico della luce visibile che passa attraverso il campione in differenza di ampiezza, migliorando così il contrasto tra varie strutture e rendendole chiare e visibili. Dopo aver attraversato il campione, la luce subisce rifrazione, deviando dal percorso ottico originale ed essendo ritardato di 1/4 λ (lunghezza d'onda). Se la differenza del percorso ottico viene aumentata o ridotta di un altro 1/4 λ, la differenza del percorso ottico diventa 1/2 λ e l'interferenza tra i due travi di luce aumenta o diminuisce dopo che l'asse è combinato, migliorando il contrasto.
