Differenze e caratteristiche del microscopio a fluorescenza e del microscopio ottico ordinario
Il microscopio a fluorescenza e il microscopio ottico ordinario sono diversi, non è attraverso l'illuminazione della normale sorgente luminosa per osservare il campione, ma l'uso di una certa lunghezza d'onda della luce (solitamente ultravioletta, luce blu-viola) per l'eccitazione del materiale fluorescente all'interno del campione sotto il microscopio, in modo che la fluorescenza della sorgente luminosa del microscopio a fluorescenza non riproduca un'illuminazione diretta, ma come una sorta di eccitazione del materiale fluorescente all'interno del campione della fonte di energia. Il motivo per cui possiamo osservare il campione non è dovuto all'illuminazione della sorgente luminosa, ma al fenomeno di fluorescenza presentato dal materiale fluorescente nel campione dopo aver assorbito l'energia luminosa di eccitazione. Si può vedere che le caratteristiche del microscopio a fluorescenza, principalmente la sua sorgente luminosa, possono fornire un gran numero di specifici intervalli di lunghezze d'onda della luce di eccitazione, in modo che il materiale fluorescente all'interno del campione esaminato possa ottenere l'intensità necessaria della luce di eccitazione. Allo stesso tempo, il microscopio a fluorescenza deve disporre di un corrispondente sistema di filtri. Il microscopio a fluorescenza è lo strumento di base per l'istochimica della fluorescenza. È composto da una sorgente luminosa ad altissima pressione, un sistema di filtri (inclusa la piastra del filtro di eccitazione e soppressione), un sistema ottico, un sistema fotografico e altri componenti principali, utilizza una determinata lunghezza d'onda della luce per stimolare il campione a emettere fluorescenza.
1. il modo di eccitazione della fluorescenza: in base alla gamma di lunghezze d'onda della luce è diviso in metodo di eccitazione UV (utilizzando illuminazione ultravioletta) e metodo di eccitazione BV (utilizzando luce blu viola) due tipi di metodo di eccitazione UV sono più brevi di 400 nm vicino alla luce ultravioletta per eccitazione. In questo metodo non è presente luce di eccitazione visibile, quindi la fluorescenza osservata mostra la fluorescenza intrinseca del colorante ed è facile distinguere la fluorescenza specifica sul campione dall'autofluorescenza del tessuto di fondo.
2. Metodo di eccitazione BV: il metodo è incentrato su 404 nm, 434 nm dalla luce ultravioletta a quella blu per l'eccitazione. Questo metodo utilizza la luce blu per irradiare il campione, quindi il filtro cut-off del sistema di osservazione della fluorescenza deve utilizzare un filtro in grado di bloccare completamente la luce blu e di far passare adeguatamente la fluorescenza verde e gialla desiderata. Pigmenti fluorescenti per il metodo con anticorpi fluorescenti. Poiché la lunghezza d'onda del massimo assorbimento della luce di eccitazione e la lunghezza d'onda della massima emissione della fluorescenza sono vicine tra loro, i filtri utilizzati nel metodo di eccitazione BV devono essere filtri a taglio netto. Questo metodo utilizza la luce blu come luce di eccitazione, quindi l'efficienza di assorbimento del fluorocromo è maggiore e si può ottenere un'immagine più luminosa. Lo svantaggio è che la fluorescenza al di sotto di 500 nm non è visibile, mentre al di sopra di 500 nm l'intera immagine appare gialla. Nel metodo con anticorpi fluorescenti, la maggior parte della specificità è giudicata dal colore unico del fluorocromo, quindi gli svantaggi del metodo di eccitazione BV sopra descritto tendono ad essere estremamente influenti quando si parla di specificità sottile.
