Caratteristiche e applicazioni della microscopia laser confocale
Il microscopio confocale a scansione laser (LSCM) è un tipo di microscopio progettato sulla base della tecnologia del fuoco coniugato, ovvero per rendere la sorgente di luce laser, il campione in esame e il rilevatore tutti nella posizione coniugata l'uno dell'altro.
Fondamentale
Nei microscopi generali, il piano focale della lente dell'obiettivo coincide con il rivelatore in modo che il piano dell'immagine osservato sia isolato dal piano assiale adiacente, mentre nei microscopi confocali, il campione viene illuminato utilizzando un punto luminoso a diffrazione limitata, e nel Questo effetto di isolamento si ottiene utilizzando un foro stenopeico nel percorso della luce di raccolta nel punto focale del coniugato spot per filtrare la luce diffusa e migliorare la risoluzione.
Caratteristiche dell'immagine
Solo la luce riflessa dallo strato del campione coniugato può passare attraverso il piccolo foro nel percorso della luce di raccolta e i rimanenti riflessi dello strato del campione irrilevanti vengono bloccati dal piccolo foro. Ciò può comportare un aumento significativo della risoluzione. Di seguito è mostrato un confronto fianco a fianco della microscopia a fluorescenza multidimensionale e della microscopia confocale dello stesso campione spesso. Quando una serie di immagini viene scattata a diversi piani focali, può essere generato quello che viene comunemente definito "stack z" e questa immagine mostra sia i guadagni di risoluzione che di contrasto offerti dalla microscopia confocale e le cause alla base di questi guadagni. L'esame dell'immagine in cima alla pila con il piano di imaging sopra il tessuto rivela molta luce diffusa nell'immagine a fluorescenza, mentre l'immagine confocale appare nera. Questa riduzione di PSF nella direzione assiale è direttamente responsabile della differenza di risoluzione osservata all'interfaccia ottica nel mezzo dello z-stack.
Un'altra caratteristica della microscopia confocale a scansione laser è che si tratta di una tecnologia di imaging a scansione. La tradizionale tecnologia di illuminazione a campo ampio illumina l'intero campione, quindi l'immagine può essere catturata direttamente a occhio nudo o da un rilevatore, ma LSCM utilizza un raggio o più raggi focalizzati passano attraverso il campione per la scansione e l'imaging e l'immagine risultante è chiamata sezione ottica. Quanto segue mostra la differenza tra il tradizionale metodo di illuminazione a campo largo e il metodo di illuminazione confocale a scansione laser.
Pertanto, nella figura sottostante è mostrato un metodo di lavoro pratico di un moderno microscopio confocale. La luce di eccitazione emessa dal laser passa attraverso uno specchio dicroico e scansiona nelle direzioni x e y del campione attraverso una coppia di specchi vibranti. L'eccitazione (o riflessione) del campione La luce entra nel rivelatore PMT attraverso il foro stenopeico e viene registrata, e l'immagine di scansione registrata viene ricostruita dal computer per ottenere l'immagine reale del campione.
