Conteggio diretto con microscopio per microbi
Principio sperimentale
Il conteggio diretto al microscopio utilizzando un emocitometro è un metodo di conteggio microbico comunemente usato. Il vantaggio di questo metodo è che è intuitivo e veloce. Posizionare la sospensione batterica opportunamente diluita (o sospensione di spore) nella camera di conteggio tra il vetrino e il vetro di copertura dell'emocitometro e contare al microscopio. Poiché il volume della camera di conteggio è fisso (0.1mm2), può essere convertito nel numero totale di microrganismi per unità di volume in base al numero di microrganismi osservati al microscopio. Poiché questo metodo conta la somma dei batteri vivi e morti, è anche chiamato metodo del conteggio totale dei batteri.
Un emocitometro è solitamente uno speciale vetrino su cui quattro scanalature formano tre piattaforme. La piattaforma al centro è divisa in due metà da una breve scanalatura orizzontale. Una griglia è incisa sulla piattaforma su ciascun lato. Ogni griglia è divisa in nove grandi quadrati. La grande piazza al centro è la stanza del conteggio. I microrganismi vengono contati nella camera di conteggio. La struttura della scheda per il conteggio delle cellule del sangue è mostrata nella Figura Ⅷ-1.
La scala della stanza del conteggio ha generalmente due specifiche, una è che un quadrato grande è diviso in 16 quadrati centrali e ogni quadrato centrale è diviso in 25 quadrati piccoli (Figura Ⅷ-2); l'altro è un quadrato grande Il quadrato è diviso in 25 quadrati centrali e ogni quadrato centrale è diviso in 16 quadrati piccoli (Figura Ⅷ-1, C). Ma non importa che tipo di scheda di conteggio sia, il numero di quadratini in ogni quadrato grande è lo stesso, cioè 16×25=400 quadratini, come mostrato nella Figura Ⅷ-2.
La lunghezza del lato di ogni quadrato grande è di 1 mm e l'area di ogni quadrato grande è di 1 mm2. Dopo aver coperto il vetrino coprioggetto, l'altezza tra il vetrino e il vetrino coprioggetto è 0.1 mm, quindi il volume della camera di conteggio è 0.1mm3.
Durante il conteggio, di solito contare il numero totale di batteri nei cinque quadrati centrali, quindi ottenere il valore medio di ciascun quadrato centrale, quindi moltiplicare per 16 o 25 per ottenere il numero totale di batteri in un quadrato grande, quindi convertire in numero totale di batteri in 1 ml di soluzione batterica.
Attrezzatura da laboratorio
Emocitometro, microscopio, coprioggetto, capillare sterile;
Materiali sperimentali
Sospensione di Saccharomyces cerevisiae
Procedura sperimentale (metodo di conteggio diretto al microscopio microbico)
1. diluizione
Diluire correttamente la sospensione di Saccharomyces cerevisiae. Se la soluzione batterica non è densa, non è necessario diluirla.
2. Sala di conteggio microscopica
Prima di aggiungere campioni, eseguire un'ispezione microscopica della camera di conteggio della piastra di conteggio. Se c'è sporcizia, deve essere pulita prima del conteggio.
3. aggiungere il campione
Coprire la piastra dell'emocitometro pulita e asciutta con un vetrino coprioggetto, quindi utilizzare un contagocce sterile a bocca fine per far cadere una piccola goccia della soluzione diluita di Saccharomyces cerevisiae dal bordo del vetrino coprioggetto (non troppo), in modo che la soluzione batterica è vicino al divario lungo il divario. L'osmosi capillare entra da sola nella camera di conteggio e la camera di conteggio generale può essere riempita con liquido batterico. Fare attenzione a non avere bolle d'aria.
4. conteggio al microscopio
Dopo aver riposato per 5 minuti, posizionare l'emocitometro sul palco del microscopio, utilizzare prima una lente a bassa potenza per trovare la posizione della camera di conteggio, quindi passare a una lente ad alta potenza per il conteggio. Se si riscontra che la soluzione batterica è troppo densa o troppo fluida prima del conteggio, è necessario regolare nuovamente la diluizione prima del conteggio. Generalmente, la diluizione del campione richiede circa 5-10 batteri in ciascuna cellula. Ciascuna camera di conteggio seleziona i batteri in 5 griglie centrali (opzionali 4 angoli e griglie centrali) per il conteggio. I batteri sulla linea della griglia vengono generalmente contati solo sulle linee superiore e destra. In caso di germogliamento del lievito, quando la dimensione del corpo del germoglio raggiunge la metà della cellula madre, contare due batteri. Contare un campione per calcolare il contenuto batterico del campione dai valori contati nelle due camere di conteggio.
5. Pulizia dell'emocitometro
Dopo l'uso, sciacquare la piastra per il conteggio delle cellule del sangue sul rubinetto con getti d'acqua, non lavarla con oggetti duri e asciugarla da soli o con un asciugacapelli dopo il lavaggio. Esame microscopico, osservare se ci sono batteri residui o altri sedimenti in ogni cella. Se non è pulito, deve essere lavato ripetutamente finché non è pulito.
