Differenze e caratteristiche tra microscopio a fluorescenza e microscopio ottico ordinario
Il microscopio a fluorescenza è diverso dal normale microscopio ottico. Non osserva il campione attraverso l'illuminazione di una normale sorgente luminosa. Utilizza invece la luce di una certa lunghezza d'onda (solitamente luce ultravioletta, luce blu-viola) per eccitare il materiale fluorescente nel campione al microscopio, facendolo emettere fluorescenza. Pertanto, la sorgente luminosa di un microscopio a fluorescenza non serve come illuminazione diretta, ma come fonte di energia che eccita il materiale fluorescente interno del campione. Il motivo per cui possiamo osservare il campione non è dovuto all'illuminazione della sorgente luminosa, ma al fenomeno della fluorescenza causato dal materiale fluorescente nel campione che assorbe l'energia luminosa eccitata. Si può vedere che la caratteristica principale di un microscopio a fluorescenza è che la sua sorgente luminosa può fornire una grande quantità di luce di eccitazione in uno specifico intervallo di lunghezze d'onda, in modo che le sostanze fluorescenti nel campione in esame possano ottenere l'intensità necessaria di luce di eccitazione. Allo stesso tempo, i microscopi a fluorescenza devono essere dotati di corrispondenti sistemi di filtraggio. La microscopia a fluorescenza è uno strumento essenziale per l'istochimica a fluorescenza avanzata. È composto da una sorgente luminosa ad altissima pressione, un sistema di filtri (comprese le piastre filtranti di eccitazione e soppressione), un sistema ottico e un sistema fotografico. Utilizza la luce di una certa lunghezza d'onda per eccitare il campione ad emettere fluorescenza.
1. Modi per eccitare la fluorescenza: in base alla gamma di lunghezze d'onda della luce, è divisa in due tipi: metodo di eccitazione UV (utilizzando il metodo di illuminazione ultravioletta) e metodo di eccitazione BV (utilizzando luce blu-viola). Il metodo di eccitazione UV utilizza per l'eccitazione una luce quasi ultravioletta inferiore a 400 nm. In questo metodo non è presente luce di eccitazione visibile, quindi la fluorescenza osservata mostra la fluorescenza intrinseca del colorante, rendendo facile distinguere la fluorescenza specifica sul campione dall'autofluorescenza del tessuto di fondo.
2. Metodo di eccitazione BV: eccitazione dalla luce ultravioletta a quella blu centrata a 404 nm e 434 nm. Questo metodo utilizza la luce blu per illuminare il campione, quindi il filtro cut-off del sistema di osservazione della fluorescenza deve utilizzare un filtro in grado di bloccare completamente la luce blu e di far passare completamente la fluorescenza verde e gialla richiesta. Coloranti fluorescenti utilizzati nei metodi con anticorpi fluorescenti. La lunghezza d'onda di assorbimento massima della luce di eccitazione e la lunghezza d'onda di emissione massima della fluorescenza sono relativamente vicine, quindi il filtro utilizzato nel metodo di eccitazione BV deve utilizzare un filtro di taglio netto. Questo metodo può utilizzare la luce blu come luce di eccitazione, quindi l'efficienza di assorbimento dei pigmenti fluorescenti è maggiore e si possono ottenere immagini più luminose. Lo svantaggio è che la fluorescenza inferiore a 500 nm non può essere vista, mentre la fluorescenza superiore a 500 nm fa apparire gialla l'intera immagine. Nel metodo con anticorpi fluorescenti, la specificità del colorante fluorescente viene giudicata principalmente dal suo colore unico. Pertanto, quando si parla della sottile specificità, i difetti sopra menzionati del metodo di eccitazione BV hanno spesso un grande impatto.
