Differenze, vantaggi e svantaggi tra la microscopia a fluorescenza a trasmissione e la microscopia a fluorescenza a riflessione
1. Microscopio a fluorescenza a trasmissione: la sorgente luminosa di eccitazione viene trasmessa attraverso il materiale del campione attraverso un condensatore per eccitare la fluorescenza. I concentratori di campo scuro comunemente usati, o concentratori ordinari, possono essere utilizzati per regolare il riflettore per convertire la luce di eccitazione e la luce laterale sul campione. Questo è un microscopio a fluorescenza relativamente vecchio stile. Il suo vantaggio è una forte fluorescenza a basso ingrandimento, mentre lo svantaggio è che la sua fluorescenza si indebolisce con l'aumentare dell'ingrandimento. Pertanto, è meglio osservare campioni di materiali più grandi.
2. Microscopio a fluorescenza a fascio cadente: questo è un nuovo tipo di microscopio a fluorescenza che si è sviluppato nei tempi moderni. A differenza della precedente, la luce di eccitazione cade dalla lente dell'obiettivo sulla superficie del campione, utilizzando la stessa lente dell'obiettivo come condensatore di illuminazione e la lente dell'obiettivo per raccogliere la fluorescenza. È necessario aggiungere un separatore di raggio bicolore al percorso ottico, che forma un angolo di 45 gradi con il fotouranio. La luce di eccitazione viene riflessa nella lente dell'obiettivo e si raccoglie sul campione. La fluorescenza generata dal campione e la luce di eccitazione riflessa dalla superficie della lente dell'obiettivo e dal vetro di copertura entrano simultaneamente nella lente dell'obiettivo e ritornano al separatore di fascio a doppio colore, separando la luce di eccitazione e la fluorescenza. La luce di eccitazione residua viene quindi assorbita dal filtro di bloccaggio. Se vengono utilizzate diverse combinazioni di filtri di eccitazione, separatori di fasci a doppio colore e filtri di blocco, possono soddisfare le esigenze di diversi prodotti di reazione fluorescente. I vantaggi di questo microscopio a fluorescenza sono l'illuminazione uniforme del campo visivo, l'immagine chiara e una fluorescenza più forte con un ingrandimento maggiore.
I vantaggi e gli svantaggi della microscopia a fluorescenza a trasmissione
Sorgente luminosa: lampada al mercurio ad alta pressione o lampada alogena.
Specchio faretto: utilizzo di un faretto a campo scuro per separare l'eccitazione e la fluorescenza.
Lente dell'obiettivo: è possibile utilizzare qualsiasi tipo di lente dell'obiettivo.
Campione: i campioni sottili sono più adatti per l'osservazione della trasmissione.
Vantaggi: ① Grazie all'uso di un condensatore a campo scuro, la luce di eccitazione non può entrare nella lente dell'obiettivo, facilitando la formazione di uno sfondo scuro e ottenendo un buon contrasto; qualsiasi lente dell'obiettivo può essere utilizzata per l'osservazione. ② Quando si utilizza un obiettivo a basso ingrandimento, è più luminoso di un microscopio a fluorescenza riflettente.
Svantaggio: il centro e l'altezza del faretto devono essere regolati correttamente, altrimenti non è possibile ottenere un'immagine fluorescente brillante. A causa della limitazione della lunghezza focale del faretto a campo scuro, non è possibile utilizzare vetrini spessi. L'area di illuminazione del campo visivo non deve essere troppo grande, altrimenti potrebbe sbiadire il colore della fluorescenza del campione fluorescente. I campioni spessi o opachi non sono adatti.
I vantaggi e gli svantaggi della microscopia a fluorescenza riflettente
Sorgente luminosa: lampada al mercurio ad alta pressione o lampada alogena.
Lente di messa a fuoco: poiché la lente dell'obiettivo funge da lente di messa a fuoco, non è necessaria una lente di messa a fuoco.
Lente dell'obiettivo: la lente dell'obiettivo utilizzata deve essere in grado di trasmettere sufficiente luce ultravioletta e di non produrre fluorescenza stessa, senza limitazioni sull'apertura numerica.
Campione: si possono osservare sia campioni spessi che opachi.
Vantaggi: ① Poiché la lente dell'obiettivo funge anche da riflettore, non richiede grandi regolazioni. ② Utilizzando il metodo di illuminazione Kolar, è possibile sfruttare gli effetti dell'apertura e delle aperture del campo visivo. L'apertura numerica della lente dell'obiettivo non è limitata e si possono ottenere immagini ad alta risoluzione anche con un ingrandimento elevato. È inoltre possibile ottenere campioni spessi o opachi osservato e possono essere utilizzati anche vetrini coprioggetto spessi. Altri metodi di osservazione possono anche essere combinati con la fluorescenza riflessa, in particolare con il metodo della differenza di fase e il metodo dell'interferenza differenziale di trasmissione. Può evitare inutili fenomeni di sbiadimento del colore della fluorescenza.
Svantaggio: quando si utilizza un obiettivo con ingrandimento da terra, l'immagine è relativamente scura, quindi è necessario utilizzare un obiettivo con apertura numerica elevata. Il sistema di filtraggio deve separare efficacemente la luminescenza di eccitazione e la fluorescenza.,
