Differenza tra microscopio a fluorescenza e microscopio normale
1. Guarda il metodo di illuminazione
Il metodo di illuminazione del microscopio a fluorescenza è generalmente di tipo epi, vale a dire che la sorgente luminosa viene posizionata sul campione di prova attraverso la lente dell'obiettivo.
2. Guarda la risoluzione
I microscopi a fluorescenza utilizzano la luce ultravioletta come sorgente luminosa, con una lunghezza d'onda relativamente corta, ma la risoluzione è superiore a quella dei normali microscopi ottici.
3, la differenza nel filtro
Il microscopio a fluorescenza utilizza due filtri speciali, utilizzati davanti alla sorgente luminosa per filtrare la luce visibile e utilizzati tra la lente dell'obiettivo e l'oculare per filtrare la luce ultravioletta, che può proteggere gli occhi umani.
Il microscopio a fluorescenza è anche un tipo di microscopio ottico, principalmente perché la lunghezza d'onda eccitata dal microscopio a fluorescenza è breve, quindi questo porta alla differenza nella struttura e nell'uso del microscopio a fluorescenza e del microscopio ordinario. La maggior parte dei microscopi a fluorescenza ha una buona funzione di catturare la luce debole. , quindi in condizioni di fluorescenza estremamente debole, anche la sua capacità di imaging è buona. Insieme al continuo miglioramento della microscopia a fluorescenza negli ultimi anni, anche il rumore è stato notevolmente ridotto. Pertanto, vengono utilizzati sempre più microscopi a fluorescenza.
Conoscenza della microscopia a fluorescenza a due fotoni
Il principio di base dell'eccitazione a due fotoni è: nel caso di un'elevata densità di fotoni, le molecole fluorescenti possono assorbire due fotoni a lunghezza d'onda lunga contemporaneamente e, dopo una durata molto breve del cosiddetto stato eccitato, emettere un fotone a lunghezza d'onda corta ; l'effetto è lo stesso dell'utilizzo di un fotone con una lunghezza d'onda pari alla metà della lunghezza d'onda lunga per eccitare una molecola fluorescente. L'eccitazione a due fotoni richiede un'elevata densità di fotoni e, per non danneggiare le cellule, la microscopia a due fotoni utilizza laser pulsati bloccati in modalità ad alta energia. Questo laser emette luce laser con alta energia di picco e bassa energia media, con un'ampiezza di impulso di soli 100 femtosecondi e una frequenza da 80 a 100 MHz. Quando viene utilizzata una lente dell'obiettivo ad alta apertura numerica per focalizzare i fotoni del laser pulsato, la densità dei fotoni nel punto focale della lente dell'obiettivo è la più alta e l'eccitazione a due fotoni si verifica solo nel punto focale della lente dell'obiettivo, quindi il microscopio a due fotoni non necessita di un foro stenopeico confocale, che migliora l'efficienza di rilevamento della fluorescenza.
Nel fenomeno generale della fluorescenza, a causa della bassa densità di fotoni della luce di eccitazione, una molecola fluorescente può assorbire solo un fotone contemporaneamente e quindi emettere un fotone fluorescente attraverso la transizione di radiazione, che è chiamata fluorescenza a singolo fotone. Per il processo di eccitazione della fluorescenza con il laser come sorgente luminosa, può verificarsi un fenomeno di fluorescenza a due fotoni o anche a più fotoni. In questo momento, l'intensità della sorgente luminosa di eccitazione utilizzata è elevata e la densità dei fotoni soddisfa il requisito che la molecola fluorescente assorba due fotoni contemporaneamente. Nel processo di utilizzo di un laser generico come sorgente di luce di eccitazione, la densità dei fotoni non è ancora sufficiente per produrre un assorbimento di due fotoni. Di solito viene utilizzato un laser pulsato a femtosecondi e la sua potenza istantanea può raggiungere l'ordine dei megawatt. Pertanto, la lunghezza d'onda della fluorescenza a due fotoni è più corta della lunghezza d'onda della luce di eccitazione, che è equivalente all'effetto prodotto dall'eccitazione della lunghezza d'onda di mezza eccitazione.
La microscopia a fluorescenza a due fotoni presenta molti vantaggi:
1) La luce a lunghezza d'onda lunga è meno influenzata dalla diffusione rispetto alla luce a lunghezza d'onda corta e può facilmente penetrare nel campione;
2) Le molecole fluorescenti al di fuori del piano focale non sono eccitate, in modo che più luce di eccitazione possa raggiungere il piano focale, in modo che la luce di eccitazione possa penetrare campioni più profondi;
3) La luce nel vicino infrarosso a lunghezza d'onda lunga è meno tossica per le cellule rispetto alla luce a lunghezza d'onda corta;
4) Quando si osservano i campioni con la microscopia a due fotoni, il fotosbiancamento e la fototossicità sono presenti solo sul piano focale. Pertanto, la microscopia a due fotoni è più adatta per la visualizzazione di campioni spessi rispetto alla microscopia a singolo fotone, per la visualizzazione di cellule viventi o per l'esecuzione di esperimenti di fotosbiancamento a punto fisso.
Conoscenza della microscopia confocale a fluorescenza
Il principio di base della microscopia a fluorescenza confocale: utilizzando una sorgente luminosa puntiforme per illuminare il campione, si forma sul piano focale un piccolo punto luminoso con un contorno ben definito. costituito dal divisore di fascio. Il divisore di fascio invia la fluorescenza direttamente al rivelatore. C'è un foro stenopeico davanti alla sorgente luminosa e al rilevatore, rispettivamente chiamato foro stenopeico di illuminazione e foro stenopeico di rilevamento. Le dimensioni geometriche dei due sono le stesse, circa 100-200 nm; rispetto al punto luminoso sul piano focale, i due sono coniugati, cioè il punto luminoso passa attraverso una serie di lenti, e infine può essere focalizzato contemporaneamente sul foro stenopeico di illuminazione e sul foro stenopeico di rilevamento. In questo modo, la luce proveniente dal piano focale può essere concentrata all'interno del raggio del foro di rilevamento, mentre la luce diffusa dall'alto o dal basso del piano focale viene bloccata fuori dal foro di rilevamento e non può essere ripresa. Il campione viene scansionato punto per punto con il laser, e il tubo fotomoltiplicatore dopo aver rilevato il foro stenopeico ottiene punto per punto anche l'immagine confocale del corrispondente punto luce, che viene convertita in segnale digitale e trasmessa al computer, ed infine aggregata su lo schermo in una chiara immagine confocale dell'intero piano focale. .
Ogni immagine del piano focale è in realtà una sezione trasversale ottica del campione, e questa sezione trasversale ottica ha sempre un certo spessore, noto anche come fetta ottica. Poiché l'intensità della luce nel punto focale è molto maggiore di quella nel punto non focale e la luce del piano non focale viene filtrata dal foro stenopeico, la profondità di campo del sistema confocale è approssimativamente zero e la scansione lungo il L'asse Z può realizzare la tomografia ottica, formando l'Osservare una sezione ottica bidimensionale nel punto focalizzato del campione. Combinando la scansione del piano XY (piano focale) con la scansione dell'asse Z (asse ottico), accumulando immagini bidimensionali di strati successivi ed elaborando con uno speciale software per computer, è possibile ottenere un'immagine tridimensionale del campione.
Cioè, il foro stenopeico di rilevamento e il foro stenopeico della sorgente luminosa sono sempre focalizzati sullo stesso punto, in modo che la fluorescenza eccitata al di fuori del piano di focalizzazione non possa entrare nel foro stenopeico di rilevamento.
La semplice espressione del principio di funzionamento del laser confocale è che utilizza un laser come sorgente luminosa e, sulla base dell'imaging tradizionale del microscopio a fluorescenza, sono collegati un dispositivo di scansione laser e un dispositivo di messa a fuoco coniugato e l'acquisizione e l'elaborazione di immagini digitali sistema è controllato da un computer.
