Differenza tra un microscopio a fluorescenza e un microscopio normale
Recentemente ho provato a realizzare alcune sezioni congelate di topi. Successivamente, utilizzerò un microscopio a fluorescenza per vedere se il virus che ho iniettato si trova nell’area del cervello che desidero. È necessario apprendere brevemente alcuni principi di base della microscopia a fluorescenza e li condividerò qui.
I microscopi a fluorescenza utilizzano la luce ultravioletta come sorgente luminosa per illuminare l'oggetto da ispezionare, facendo sì che l'oggetto emetta luce, quindi osservando l'oggetto al microscopio. Viene utilizzato principalmente per le cellule di immunofluorescenza. È composto principalmente da una sorgente luminosa, un sistema di piastre filtranti e un sistema ottico. L'immagine fluorescente del campione viene osservata attraverso l'ingrandimento dell'oculare e della lente dell'obiettivo. Diamo un'occhiata alla differenza tra un microscopio a fluorescenza e un normale microscopio ottico.
1. Guarda il metodo di illuminazione
Il metodo di illuminazione del microscopio a fluorescenza è generalmente l'epiilluminazione, il che significa che la sorgente luminosa viene posizionata sul campione da testare attraverso la lente dell'obiettivo.
2. Guarda la risoluzione
I microscopi a fluorescenza utilizzano la luce ultravioletta come sorgente luminosa, che ha una lunghezza d'onda più corta ma una risoluzione più elevata rispetto ai normali microscopi ottici.
3. Differenze nei filtri
I microscopi a fluorescenza utilizzano due filtri speciali, uno utilizzato davanti alla sorgente luminosa per filtrare la luce visibile e uno utilizzato tra la lente dell'obiettivo e l'oculare per filtrare i raggi ultravioletti, che possono proteggere gli occhi umani.
Il microscopio a fluorescenza è anche un tipo di microscopio ottico. Il motivo principale è che la lunghezza d'onda eccitata dal microscopio a fluorescenza è breve, quindi questo porta alla differenza nella struttura e nell'uso tra il microscopio a fluorescenza e il microscopio normale. La maggior parte dei microscopi a fluorescenza hanno una buona funzione di catturare la luce debole. , quindi la sua capacità di imaging è buona anche in condizioni di fluorescenza estremamente debole. Insieme al continuo miglioramento dei microscopi a fluorescenza negli ultimi anni, anche il rumore è stato notevolmente ridotto. Pertanto vengono utilizzati sempre più microscopi a fluorescenza.
Conoscenza della microscopia a fluorescenza a due fotoni
Il principio di base dell'eccitazione a due fotoni è: in condizioni di elevata densità di fotoni, le molecole fluorescenti possono assorbire due fotoni a lunga lunghezza d'onda contemporaneamente e, dopo una breve durata del cosiddetto stato eccitato, emettere un fotone con una lunghezza d'onda più corta . ;L'effetto è lo stesso che si ottiene utilizzando un fotone con una lunghezza d'onda pari alla metà della lunghezza d'onda lunga per eccitare le molecole fluorescenti. L'eccitazione a due fotoni richiede un'elevata densità di fotoni. Per non danneggiare le cellule, i microscopi a due fotoni utilizzano laser a impulsi con modalità bloccata ad alta energia. Questo laser emette luce laser con energia di picco elevata e energia media bassa, con una larghezza di impulso di soli 100 femtosecondi e una frequenza compresa tra 80 e 100 MHz. Quando si utilizza una lente dell'obiettivo ad alta apertura numerica per focalizzare i fotoni del laser pulsato, la densità dei fotoni al fuoco della lente dell'obiettivo è la più alta. L'eccitazione a due fotoni avviene solo al fuoco della lente dell'obiettivo, quindi il microscopio a due fotoni non richiede un foro stenopeico confocale, il che migliora l'efficienza di rilevamento della fluorescenza.
Nel fenomeno generale della fluorescenza, a causa della bassa densità di fotoni della luce di eccitazione, una molecola fluorescente può assorbire solo un fotone alla volta e quindi emettere un fotone di fluorescenza attraverso una transizione radiativa. Questa è la fluorescenza a fotone singolo. Nel processo di eccitazione della fluorescenza che utilizza il laser come sorgente luminosa possono verificarsi fenomeni di fluorescenza a due fotoni o anche a più fotoni. In questo caso l'intensità della sorgente luminosa di eccitazione utilizzata è elevata e la densità dei fotoni soddisfa il requisito che le molecole fluorescenti assorbano due fotoni contemporaneamente. Nel processo di utilizzo dei laser ordinari come sorgenti di luce di eccitazione, la densità dei fotoni non è ancora sufficiente per produrre un assorbimento di due fotoni. Di solito vengono utilizzati laser a impulsi a femtosecondi e la loro potenza istantanea può raggiungere il livello di megawatt. Pertanto, la lunghezza d'onda della fluorescenza a due fotoni è inferiore alla lunghezza d'onda della luce di eccitazione, il che è equivalente all'effetto prodotto dall'eccitazione della lunghezza d'onda di mezza eccitazione.
