Determinazione del numero di microrganismi: il metodo di conteggio diretto del microscopio!
La crescita della popolazione batterica si manifesta con un aumento del numero di cellule o un aumento della massa cellulare. I metodi per determinare il numero di cellule includono il metodo di conteggio al microscopio diretto, il metodo di conteggio delle colonie su piastra, il metodo del rapporto dell'olio fotoelettrico, il metodo della massima probabilità e il metodo di filtrazione della membrana. I metodi di misurazione della materia cellulare includono la determinazione del peso secco cellulare, la determinazione di alcuni componenti cellulari come il contenuto di azoto, RNA e DNA e la determinazione dei metaboliti. Insomma, esistono molti metodi per misurare la crescita dei microrganismi, ognuno con i propri vantaggi e svantaggi, e va scelto in base alla situazione specifica. Questo esperimento introduce principalmente il metodo di conteggio diretto al microscopio comunemente utilizzato nella produzione e nella ricerca scientifica.
1. Finalità Requisiti
1. Chiarire il principio del conteggio delle cellule del sangue.
2. Padroneggia il metodo di conteggio dei microrganismi utilizzando un contatore di cellule del sangue.
2. Principi di base
Il metodo di conteggio diretto al microscopio è un metodo semplice, veloce e intuitivo per contare direttamente una piccola quantità di sospensione del campione da testare su uno speciale vetrino con una certa area e volume (noto anche come contatore di batteri). Metodi. Attualmente, i contatori di batteri comunemente usati in patria e all'estero sono: scheda per il conteggio delle cellule del sangue, contatore di batteri Peteroff-Hauser e contatore di batteri Hawksley, ecc. Possono essere utilizzati per il conteggio di lieviti, batteri, spore di muffe e altre sospensioni, e il principio di base è lo stesso. Gli ultimi due tipi di contatori batterici hanno un volume totale di 0.02 mm3 dopo essere stati coperti con un vetrino coprioggetto e la distanza tra il vetrino coprioggetto e il vetrino è di soli 0,02 mm, quindi l'olio la lente dell'obiettivo ad immersione può essere utilizzata per osservare e osservare piccole cellule come i batteri. contare. Oltre a questi batteriometri esiste anche un metodo di stima del rapporto tra l'area dello striscio e l'area del campo visivo osservata direttamente al microscopio, generalmente utilizzato per l'esame batteriologico del latte. I vantaggi del metodo di conteggio diretto del microscopio sono intuitivi, veloci e facili da usare. Tuttavia, lo svantaggio di questo metodo è che il risultato misurato è solitamente la somma di cellule morte e vive. Al momento, esistono alcuni metodi per superare questa lacuna, come la combinazione di batteri vitali che colorano la coltura in microcamere (breve tempo) e l'aggiunta di inibitori della divisione cellulare per raggiungere lo scopo di contare solo i batteri vitali.
In questo esperimento, un emocitometro è stato utilizzato come esempio per il conteggio microscopico diretto. Per l'utilizzo degli altri due tipi di contabatterici fare riferimento alle istruzioni di ciascun produttore. Il conteggio diretto al microscopio con un emocitometro è un metodo comunemente usato per contare i microrganismi. Il piatto di conteggio è uno speciale vetrino scorrevole, sul quale sono formate tre piattaforme da quattro fessure; la piattaforma più ampia al centro è divisa in due metà da una breve fessura trasversale e vi è una griglia su ciascun lato della piattaforma. Ogni griglia è divisa in nove grandi quadrati e il grande quadrato al centro è la stanza del conteggio. La struttura della piastra per il conteggio delle cellule del sangue è mostrata nella Figura l{{{{10}}}}. La scala della stanza del conteggio ha generalmente due specifiche, una è un quadrato grande diviso in 25 quadrati centrali e ogni quadrato centrale è diviso in 16 quadrati piccoli (Figura 15-2); l'altro è una grande piazza. Il quadrato è diviso in 16 quadrati centrali e ogni quadrato centrale è diviso in 25 quadrati piccoli, ma non importa che tipo di tabellone di conteggio sia, ci sono 400 quadrati piccoli in ogni quadrato grande. La lunghezza del lato di ogni quadrato grande è di 1 mm e l'area di ogni quadrato grande è di 1 mm2. Dopo la copertura con un vetrino coprioggetto, l'altezza tra il vetrino coprioggetto e il vetro del vetrino è di 0,1 mm, quindi il volume della camera di conteggio è di 0, lmm3 (un millesimo di millilitro). Figura 15-1 La struttura del pannello per il conteggio delle cellule del sangue (1) Figura 15-2 La struttura del pannello per il conteggio delle cellule del sangue (2) A. Vista frontale; B. Vista in sezione longitudinale; La griglia ingrandita, il grande quadrato al centro è la camera di conteggio 1. Piastra di conteggio delle cellule del sangue; 2. Coprire il vetro; 3. Quando si esegue il conteggio nella camera di conteggio, di solito si conta il numero totale di batteri in cinque quadrati, quindi si calcola la media di ciascun quadrato e si moltiplica per 25 o 16 per ottenere Il numero totale di batteri in un quadrato grande viene quindi convertito nel numero numero totale di batteri in 1 ml di soluzione batterica. Sia A il numero totale di batteri nei cinque quadrati e B il rapporto di diluizione della soluzione batterica. Se si tratta di una piastra di conteggio con 25 quadrati, il numero totale di batteri in 1 mL di soluzione batterica {{26} } A/5×25×104× B=50000A·B(pezzi) Allo stesso modo, se si tratta di una piastra di conteggio con 16 quadrati medi, il numero totale di batteri in 1 ml di soluzione batterica=A/ 5×16×104×B=32000A·B (pezzi)
3. Attrezzatura
1. Batteri
Saccharomyces cerevisiae
2. Strumenti o altri utensili
Emocitometro, microscopio, coprioggetto, contagocce capillare sterile.
4. Fasi operative
1. Preparazione della sospensione batterica
Saccharomyces cerevisiae è stato preparato in una sospensione batterica di concentrazione appropriata con soluzione fisiologica sterile.
2. Sala contamicroscopi
Prima di aggiungere campioni, ispezionare microscopicamente la camera di conteggio della piastra di conteggio. Se c'è dello sporco, deve essere pulito e asciugato prima del conteggio.
3. Aggiungere il campione
Coprire l'emocitometro pulito e asciutto con un coprioggetto, quindi utilizzare un contagocce capillare sterile per far cadere una piccola goccia della sospensione di Saccharomyces cerevisiae agitata dal bordo del coprioggetto e lasciare che la soluzione batterica si sposti automaticamente lungo lo spazio per osmosi capillare. Entrando nella stanza di conteggio, la stanza di conteggio generale può essere riempita di liquido batterico. Durante il campionamento agitare prima la soluzione batterica; quando si aggiungono campioni, non devono formarsi bolle d'aria nella camera di conteggio.
4. Conteggio al microscopio
Dopo aver aggiunto il campione, rimanere fermi per 5 minuti, quindi posizionare l'emocitometro sul tavolino del microscopio, trovare prima la posizione della camera di conteggio con un microscopio a bassa potenza, quindi passare a un microscopio ad alta potenza per il conteggio. Regolare l'intensità della luce del microscopio in modo appropriato. Per i microscopi che utilizzano specchi per l'illuminazione, prestare attenzione a non deviare da un lato della luce, altrimenti non sarà facile vedere chiaramente le linee quadrate della stanza di conteggio nel campo visivo, oppure solo le linee verticali o orizzontali essere visto. Se si riscontra che la soluzione batterica è troppo concentrata o troppo diluita prima del conteggio, è necessario regolare nuovamente la diluizione prima del conteggio. Generalmente, la diluizione del campione richiede da 5 a 10 batteri in ogni piccola cellula. Ciascuna camera di conteggio seleziona 5 celle centrali (opzionali 4 angoli e una cella centrale al centro) per il conteggio. Le celle situate sulla linea della griglia vengono generalmente contate solo sulle linee superiore e destra. Nel caso del germogliamento del lievito, quando la dimensione del germoglio raggiunge la metà della cellula madre, viene conteggiata come due cellule batteriche. Per contare un campione, calcolare il contenuto batterico del campione calcolando il valore medio dalle due camere di conteggio.
5. Lavare il conteggio delle cellule del sangue
Dopo l'uso, sciacquare la scheda di conteggio delle cellule del sangue con acqua nel rubinetto, non strofinare con oggetti duri e asciugarla da soli o con un asciugacapelli dopo il lavaggio. Esame microscopico per osservare se ci sono batteri residui o altri sedimenti in ogni piccola cellula. Se non è pulito, deve essere lavato ripetutamente finché non è pulito.
