Confronto tra microscopio confocale e microscopio ottico ordinario
Microscopio ottico generale
Il microscopio biologico generale è costituito da tre parti, vale a dire: ① sistema di illuminazione, comprendente sorgente luminosa e condensatore; ② Il sistema di amplificazione ottica, costituito da obiettivo e oculare, è il corpo principale del microscopio. Per eliminare l'aberrazione sferica e l'aberrazione cromatica, sia l'oculare che l'obiettivo sono composti da gruppi di lenti complessi; (3) dispositivo meccanico, utilizzato per il fissaggio dei materiali e l'osservazione conveniente.
La nitidezza o meno dell'immagine al microscopio dipende non solo dall'ingrandimento, ma anche dalla risoluzione del microscopio. La risoluzione si riferisce alla capacità del microscopio (o del luogo in cui gli occhi umani sono a 25 cm di distanza dal bersaglio) di distinguere il piccolo intervallo dell'oggetto zui. La risoluzione dipende dalla lunghezza d'onda della luce, dal rapporto di apertura e dall'indice di rifrazione del mezzo, che è espresso dalla formula:
R=0.61λ /N．A． N．A．＝ｎpeccato /2
Dove: n= indice di rifrazione del mezzo;=angolo dello specchio (l'angolo di apertura del campione rispetto all'apertura della lente) e NA= apertura numerica. L'angolo dello specchio è sempre inferiore a 180? Pertanto, il valore zui di sina/2 deve essere inferiore a 1.
L'indice di rifrazione del vetro utilizzato per realizzare lenti ottiche è 1,65~1,78 e l'indice di rifrazione del mezzo utilizzato è più vicino a quello del vetro, meglio è. Per l'obiettivo a secco, il mezzo è l'aria e il rapporto di apertura è generalmente 0.05 ~ 0,95; La lente a olio utilizza asfalto profumato come mezzo e il tasso di apertura della lente può essere vicino a 1,5.
La lunghezza d'onda della luce ordinaria è 400~700 nm, quindi la risoluzione del microscopio non è inferiore a 0,2 μm e la risoluzione dell'occhio umano è 0,2 mm, quindi il grande ingrandimento di zui progettato da il microscopio generale è solitamente 1000X x.
Perché hai bisogno di un microscopio confocale?
1. Il microscopio ottico è stato perfezionato grazie agli sforzi e al miglioramento dei nostri grandi predecessori. Infatti, i normali microscopi possono fornirci bellissime immagini microscopiche in modo semplice e rapido. Tuttavia, si è verificato un evento che ha portato un'innovazione rivoluzionaria in questo mondo dei microscopi quasi perfetto, ovvero l'invenzione del "microscopio confocale a scansione laser". Questo nuovo microscopio è caratterizzato dall'adozione di un sistema ottico che estrae le informazioni dell'immagine solo sul piano in cui è concentrato il fuoco e ripristina le informazioni ottenute nella memoria dell'immagine mentre si cambia la messa a fuoco, in modo che un'immagine vivida con informazioni tridimensionali complete può essere ottenuto. Con questo metodo si possono ottenere semplicemente informazioni sulla forma della superficie che non possono essere confermate dai normali microscopi. Inoltre, per i normali microscopi ottici, "migliorare la risoluzione" e "aumentare la profondità di campo" sono condizioni contraddittorie, soprattutto ad alto ingrandimento, ma per i microscopi confocali questo problema è risolto.
2. Vantaggi del sistema ottico confocale
Il sistema ottico confocale illumina il punto campione e la luce riflessa viene ricevuta anche dai recettori puntiformi. Quando il campione viene messo a fuoco, quasi tutta la luce riflessa può raggiungere il fotorecettore, ma quando il campione si discosta dal fuoco, la luce riflessa non può raggiungere il fotorecettore. Ciò significa che nel sistema ottico confocale verrà emessa solo l'immagine che coincide con il fuoco e la facula e la luce diffusa inutile verranno schermate.
3. Perché usare un laser?
Nel sistema ottico confocale, il campione viene illuminato e la luce riflessa viene ricevuta anche da un fotorecettore puntiforme. Pertanto, diventa necessaria una sorgente luminosa puntiforme. Il laser appartiene a una sorgente luminosa molto puntiforme. Nella maggior parte dei casi, la sorgente luminosa del microscopio confocale adotta una sorgente luminosa laser. Inoltre, anche le caratteristiche del laser, come la monocromaticità, la direttività e l'eccellente forma del raggio, sono ragioni importanti per il suo ampio utilizzo.
4. Diventa possibile l'osservazione in tempo reale basata sulla scansione ad alta velocità.
Nella scansione laser, il deflettore ottico-acustico (elemento primario AO) viene utilizzato in direzione orizzontale e lo specchio Servo Galvano viene utilizzato in direzione verticale. Poiché non sono presenti vibrazioni meccaniche nell'unità di deflessione ottico-acustica, è possibile eseguire la scansione ad alta velocità ed è possibile osservare in tempo reale sullo schermo di monitoraggio. L'elevata velocità di questa fotocamera è un progetto molto importante che influisce direttamente sulla velocità di messa a fuoco e di recupero della posizione.
5. Relazione tra posizione di messa a fuoco e luminosità
Nel sistema ottico confocale, quando il campione è posizionato correttamente nella posizione di messa a fuoco, la luminosità è elevata e, prima e dopo di essa, la sua luminosità diminuirà drasticamente (linea continua nella Figura 4). Questa sensibile selettività del piano focale è anche il principio per misurare la direzione dell'altezza del microscopio confocale e per espandere la profondità focale. Al contrario, il microscopio ottico ordinario non presenta evidenti cambiamenti di luminosità prima e dopo la posizione di messa a fuoco (linea tratteggiata nella Figura 4).
6. Contrasto elevato e alta risoluzione
Nel microscopio ottico generale, la luce riflessa che devia dal fuoco interferirà e si sovrapporrà alla parte di imaging del fuoco, riducendo così il contrasto dell'immagine. Al contrario, nel sistema ottico confocale, la luce diffusa all'esterno del fuoco e la luce diffusa all'interno dell'obiettivo vengono quasi completamente rimosse, quindi è possibile ottenere un'immagine con un contrasto molto elevato. Inoltre, poiché la luce passa due volte attraverso la lente dell'obiettivo, l'immagine puntiforme viene prima resa più nitida e anche la risoluzione del microscopio risulta migliorata.
7. Funzione di localizzazione ottica
Nel sistema ottico confocale, la luce riflessa dalla parte diversa dal punto focale è schermata da micropori. Pertanto, quando si osserva un campione tridimensionale, si forma un'immagine simile a quella che si forma dopo aver tagliato il campione con il fuoco (Figura 5). Questo effetto è chiamato localizzazione ottica, che appartiene ad una delle specialità del sistema ottico confocale.
8. Mettere a fuoco la funzione di memoria in movimento
La cosiddetta luce riflessa all'esterno del fuoco viene schermata dai micropori. D'altra parte si può considerare che tutti i punti dell'immagine formata dal sistema ottico confocale coincidono con il fuoco. Pertanto, se il campione tridimensionale viene spostato lungo la direzione dell'asse Z (asse ottico), l'immagine verrà accumulata e archiviata nella memoria e zui alla fine otterrà l'immagine formata dalla coincidenza dell'intero campione e del fuoco . In questo modo, la funzione di profondità di messa a fuoco infinita è chiamata funzione di memoria mobile.
9. Funzione di misurazione della forma della superficie
Nella funzione di spostamento del fuoco, la forma della superficie del campione può essere misurata senza contatto aggiungendo un circuito di registrazione dell'altezza. Sulla base di questa funzione, è possibile registrare le coordinate dell'asse Z formate dall'elevato valore di luminosità di zui in ciascun pixel e, sulla base di queste informazioni, è possibile ottenere le informazioni relative alla forma della superficie del campione.
10. Funzione di misurazione micro-dimensione ad alta precisione
L'unità di ricezione della luce adotta un sensore di immagine CCD unidimensionale, quindi non può essere influenzata dall'inclinazione di scansione del dispositivo di scansione, in modo che sia possibile completare misurazioni ad alta precisione. Inoltre, poiché contemporaneamente viene adottata la funzione di memoria dello spostamento della messa a fuoco con profondità di messa a fuoco regolabile, è possibile eliminare l'errore di misurazione causato dall'offset della messa a fuoco.
11. Analisi dell'immagine tridimensionale
Utilizzando la funzione di misurazione della forma della superficie, è possibile realizzare facilmente l'immagine tridimensionale della superficie del campione. Non solo, ma si possono effettuare anche molti tipi di analisi, come ad esempio: misurazione della rugosità superficiale, area, volume, area superficiale, circolarità, raggio, lunghezza di zui, perimetro, baricentro, immagine tomografica, trasformata FFT, linea misurazione della larghezza e così via.
Il microscopio a scansione confocale laser può essere utilizzato non solo per osservare la morfologia cellulare, ma anche per l'analisi quantitativa dei componenti biochimici nelle cellule, statistiche sulla densità ottica e misurazione della morfologia cellulare.
