Vantaggi e svantaggi della microscopia a scansione laser multifotone (MLSM)
La microscopia a scansione laser multifotone è un metodo sperimentale basato sulla tecnologia della microscopia a scansione laser, che fornisce migliori capacità di sezionamento ottico per l'osservazione tridimensionale. Il metodo di eccitazione a fluorescenza multifotone utilizza la luce rossa a lunga lunghezza d'onda o la luce del vicino infrarosso per raccogliere immagini di fluorescenza ad alta risoluzione dei campioni, causando danni minimi ai campioni viventi. Pertanto, è adatto per l'imaging di cellule vive, in particolare di tessuti viventi spessi come fettine di cervello, embrioni, ecc. Studi di imaging di interi organi o addirittura di interi corpi.
I vantaggi sono i seguenti:
1. Utilizzare la luce rossa o la luce infrarossa per eccitare e la diffusione della luce è piccola (la diffusione di piccole particelle è inversamente proporzionale alla quarta potenza della lunghezza d'onda).
2. Non è necessario alcun foro stenopeico ed è possibile raccogliere più fotoni sparsi dalla sezione trasversale dell'immagine.
3. Il foro stenopeico non è in grado di distinguere i fotoni sparsi emessi dall'area sfocata o dall'area di messa a fuoco e il rapporto segnale-rumore dell'imaging multi-fotone negli strati profondi è buono.
4. La luce ultravioletta o visibile utilizzata per l'eccitazione del singolo fotone viene facilmente assorbita e attenuata dal campione prima che il raggio raggiunga il piano focale ed è difficile eccitare gli strati profondi.
5. In termini di osservazione al microscopio biologico, la prima considerazione è non danneggiare lo stato attivo dell'organismo stesso e mantenere il flusso di acqua, la concentrazione di ioni, ossigeno e sostanze nutritive. Nel caso dell'osservazione della luce, sia il calore che l'energia dei fotoni devono rimanere entro la quantità di irradiazione e l'energia luminosa affinché le cellule non vengano danneggiate.
6. Anche la microscopia multifotone presenta molti vantaggi. Ad esempio, in termini di risoluzione tridimensionale, penetrazione in profondità, efficienza di diffusione, luce di fondo, rapporto segnale-rumore, controllo, ecc., ci sono caratteristiche trascendenti che i precedenti microscopi laser non avevano o non potevano eguagliare.
La microscopia confocale a scansione laser multifotone è stata estesa a vari campi di ricerca e applicazione. Può condurre osservazioni tridimensionali non distruttive di campioni nel loro stato naturale e può migliorare la risoluzione e il rapporto segnale-rumore del sistema. Utilizzando materiali di eccitazione multifotone I cambiamenti nelle proprietà possono anche realizzare l'archiviazione di dati di altezza tridimensionale e microlavorazioni tridimensionali in qualsiasi direzione, che hanno un alto valore applicativo. Si ritiene che con l'ulteriore sviluppo di macchinari, materiali, tecnologia laser, ecc. relativi alla microscopia confocale multifotone, una maggiore microscopia confocale a scansione laser fotonica riceverà un maggiore sviluppo e un'applicazione più ampia.
Gli svantaggi sono i seguenti:
1. Può solo visualizzare la fluorescenza.
2. Se il campione contiene cromofori in grado di assorbire la luce di eccitazione, come i pigmenti, il campione potrebbe essere danneggiato dal calore.
3. La risoluzione è leggermente ridotta. Sebbene possa essere migliorato utilizzando contemporaneamente i fori confocali, si verificherà una perdita di segnale.
4. Limitato dai costosi laser ultraveloci, il costo dei microscopi a scansione multifotone è relativamente elevato.
