Vantaggi e svantaggi della microscopia a scansione laser multifotonica
La microscopia a scansione laser multifotone è un metodo sperimentale basato sulla tecnologia di microscopia a scansione laser, che fornisce capacità di sezionamento ottico più accurate nell'osservazione tridimensionale. Il metodo di eccitazione della fluorescenza multifotone utilizza la luce rossa a lunghezza d'onda lunga o la luce nel vicino infrarosso per raccogliere immagini di fluorescenza ad alta risoluzione di campioni, che ha un danno minimo per i campioni viventi, quindi è adatto per l'imaging di cellule vive, in particolare per tessuti viventi spessi come fette di cervello, embrioni, studi di imaging di interi organi o addirittura interi organismi.
I vantaggi sono i seguenti:
1. Eccitato dalla luce rossa o dalla luce infrarossa, la diffusione della luce è piccola (la diffusione di piccole particelle è inversamente proporzionale alla quarta potenza della lunghezza d'onda).
2. Non sono necessari fori stenopeici e possono essere raccolti più fotoni dispersi dalla sezione di imaging.
3. Il foro stenopeico non è in grado di distinguere i fotoni dispersi emessi dall'area fuori fuoco o dall'area di messa a fuoco e il rapporto segnale-rumore dell'imaging multi-fotone negli strati profondi è buono.
4. La luce ultravioletta o visibile utilizzata per l'eccitazione del singolo fotone viene facilmente assorbita e attenuata dal campione prima che il raggio raggiunga il piano focale e non è facile eccitare gli strati profondi.
5. In termini di osservazione al microscopio biologico, la prima considerazione è non danneggiare lo stato attivo dell'organismo stesso e mantenere la circolazione di acqua, concentrazione di ioni, ossigeno e sostanze nutritive. Nel caso dell'osservazione della luce, sia l'energia del calore che quella dei fotoni devono rimanere entro la quantità di irradiazione e l'energia luminosa che non danneggerà le cellule.
6. Anche la microscopia multifotonica presenta molti vantaggi. Come la risoluzione tridimensionale, la penetrazione profonda, l'efficienza di diffusione, la luce di fondo, il rapporto segnale-rumore, il controllo, ecc., ci sono caratteristiche superiori che i microscopi laser non hanno o hanno incomparabili in passato.
La microscopia a scansione laser confocale multifotone è stata estesa a vari campi di ricerca e applicazione. Può eseguire osservazioni tridimensionali non distruttive di campioni allo stato naturale e può migliorare la risoluzione e il rapporto segnale/rumore del sistema. Utilizzando materiali di eccitazione multifotone, può anche realizzare l'archiviazione di dati di altezza tridimensionale e la microfabbricazione di direzione arbitraria tridimensionale, che ha un alto valore applicativo. Si ritiene che con l'ulteriore sviluppo di macchinari, materiali e tecnologia laser relativi alla microscopia confocale multifotone, ci sarà più microscopio a scansione laser confocale fotonica che otterrà un maggiore sviluppo e un'applicazione più ampia.
Gli svantaggi sono i seguenti:
1. Solo per imaging in fluorescenza.
2. Se il campione include cromofori in grado di assorbire la luce di eccitazione, come i pigmenti, il campione potrebbe subire danni termici.
3. La risoluzione è leggermente ridotta. Sebbene possa essere migliorato utilizzando contemporaneamente l'apertura confocale, il segnale andrà perso.
4. A causa della limitazione dei costosi laser ultraveloci, il costo del microscopio a scansione multifotonica è relativamente alto.
