Vantaggi progressivi dei microscopi multifotonici a scansione laser
Il microscopio multifotone a scansione laser rappresenta un miglioramento significativo della microscopia ottica, che si manifesta principalmente nella capacità di osservare strutture profonde di cellule viventi, cellule fisse e tessuti e di ottenere strutture Z-multistrato chiare e nitide, ovvero fette ottiche, che possono essere utilizzate per costruire strutture solide tridimensionali di campioni. Il microscopio confocale utilizza una sorgente di luce laser, che viene espansa per riempire l'intero piano focale della lente dell'obiettivo e quindi converge in punti molto piccoli sul piano focale del campione attraverso il sistema di lenti della lente dell'obiettivo. Secondo l'apertura numerica della lente dell'obiettivo, il diametro del punto di illuminazione più luminoso è di circa 0,25-0,8 μ m e la profondità è di circa 0,5-1,5 μ m. La dimensione del punto confocale è determinata dal design del microscopio, dalla lunghezza d'onda del laser, dalle caratteristiche dell'obiettivo, dalle impostazioni dello stato dell'unità di scansione e dalle proprietà del campione. Il campo di illuminazione e la profondità di un microscopio di campo sono ampi, mentre l'illuminazione di un microscopio confocale è focalizzata su un punto focale sicuro sul piano focale. Il vantaggio più fondamentale della microscopia confocale è che può eseguire un sezionamento ottico fine su campioni fluorescenti spessi (fino a 50 μm o più), con uno spessore compreso tra circa 0,5 e 1,5 μm. La serie di immagini ottiche di sezioni può essere ottenuta spostando il campione su e giù utilizzando il motore passo-passo dell'asse Z-del microscopio. La raccolta delle informazioni sull'immagine è controllata all'interno di un piano sicuro e non verrà interferita da segnali emessi da altre posizioni sul campione. Dopo aver rimosso l'influenza della fluorescenza di fondo e aumentato il rapporto segnale-rumore, il contrasto e la risoluzione delle immagini confocali risultano significativamente migliorati rispetto alle tradizionali immagini in fluorescenza con illuminazione di campo. In molti esemplari, intricati componenti strutturali si intrecciano per formare sistemi complessi, ma una volta raccolte abbastanza sezioni ottiche, possiamo utilizzare il software per ricostruirle in tre dimensioni. Questo metodo sperimentale è stato ampiamente utilizzato nella ricerca biologica per chiarire le complesse relazioni strutturali e funzionali tra cellule o tessuti.
